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    2015-11-17 12:37:26      点击:
    在经历了几年的高速发展之后,新一代测序仪终于放慢了脚步。如今,样品制备成为NGS中新的亮点。新试剂、新仪器不断涌现,以缩短时间,提高通量。同时,新方法也在不断被开发,以处理更少的样本,如单细胞。这一次,生物通带您走近NGS的样品制备,看看有哪些新工具能帮助我们应对样品制备的挑战。

    首先,我们从DNA的样品制备说起。制备NGS文库需要先提取基因组DNA;将其片段化,通过凝胶电泳或磁珠选择合适大小的片段;对DNA进行末端修复,对5’端磷酸化,并在其3’端加上适当的接头;并定量最终的文库。

    片段化

    DNA片段化主要是通过物理方法(如超声剪切)或酶学方法(即非特异的核酸内切酶处理)来实现的。美国斯克里普斯研究所的Steven Head曾在《BioTechniques》杂志上发表文章,介绍NGS文库制备的现状与挑战1。据介绍,他们实验室是采用Covaris的仪器进行超声剪切。同时,Covaris超声破碎系统也是各大测序仪制造商在操作手册中大力推荐的。

    Covaris样品制备是基于专利的Adaptive Focused Acoustic(AFA)技术。它利用几何聚焦声波能量,通过>400kHz的球面固态超声传感器将波长为1mm的声波能量聚焦在样品上。这个过程是在等温的条件下进行的,确保了核酸样品的完整性得以保留,并能实现高的回收率。Covaris的仪器有多个系列,包括经济的M系列,单管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。


    配合专门设计的AFA管,Covaris仪器可精确地将DNA和RNA打断成100-1500 bp片段(microTUBE),或2-5 kb片段(miniTUBE)。对于那些需要更长DNA片段的测序应用,Covaris还开发出专利的g-TUBE™。这种管通过离心产生剪切力,能产生6-20 kb的片段。


    当然,酶切的方法也是个简单易行的好选择。我们可用DNase I来消化DNA片段。NEB公司也推出了NEBNext dsDNA Fragmentase,能产生100-800 bp的片段。它是两种酶的混合物:一种在dsDNA上产生随机切刻,另一种识别切刻位点,切割对面的DNA链,产生双链DNA断裂。dsDNA Fragmentase可用于基因组DNA、PCR产物和全基因组扩增DNA,而无论其GC含量如何。之前的研究证实,酶切法和超声法都很高效,不过Fragmentase酶切法产生了较多的artifactual indels。


    Illumina的Nextera技术也是一种酶学方法。它利用一种转座酶,能同时完成DNA片段化和接头的添加,从而减少样品处理,并节约时间。据介绍,利用Nextera DNA样品制备试剂盒,测序即用型文库可在90分钟内产生,且手动操作仅需15分钟。更吸引人的是,Nextera支持50 ng的样品,而Nextera XT更是支持几纳克的样品。


    大小选择(Size Selection)


    对于片段后的大小选择,大家通常使用贝克曼库尔特家的AMPure XP磁珠。不过如果样品质量不高(如FFPE),最好还是用凝胶电泳。凝胶电泳的优点是便宜,非常严格的选择,但不容易自动化。在点样时应特别小心,避免过量和交叉污染。对于电泳时的标准品,Illumina建议使用Promega的BenchTop 100 bp DNA ladder,因为它产生漂亮而锐利的条带。


    文库制备


    目前市场上有多家公司提供文库制备的试剂盒。竞争使得价格不断下降,而质量不断上市。这些试剂盒能从微克至皮克级的起始材料开始制备文库。不过,大家要记住一点,起始材料越多,意味着扩增越少,文库复杂性越好。


    Illumina公司之前提供TruSeq DNA Sample Preparation Kit。不过此试剂盒现在已停产,取而代之的是TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep和TruSeq Nano DNA Sample Prep。TruSeq DNA PCR-free通过去除PCR步骤,并以磁珠选择取代凝胶选择,简化了样品制备的流程。它带来了出色的覆盖度质量,并显著减少了文库偏向和覆盖度缺口。此试剂盒提供两种操作,可产生大的(550 bp)或小的(350 bp)的插入片段,支持各种应用。 
    TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit则顾名思义,需要较少的起始材料。一般试剂盒需要~1 μg的DNA,而TruSeq Nano DNA只需要100-200 ng DNA。这样,即使样本量很少,比如肿瘤样本,也能开展测序研究。TruSeq试剂盒都有高通量(HT)和低通量(LT)版本可供选择,包含试剂、样品纯化磁珠和索引。


    NEB公司也推出了30多款样品制备方面的产品(NEBNext系列),适合Illumina、454、Ion Torrent等多个平台。NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set for Illumina 是一款文库制备产品,适用于后续的定向富集或在Illumina的HiSeq或MiSeq平台上直接测序。试剂盒中包含了末端修复、加A尾和接头连接所需的全部试剂。不过,接头需要单独购买。

    此外,NEB新推出了NEBNext Ultra™ DNA Library Prep Kit。它不仅适用于少量样本(低至5 ng),还能够处理福尔马林固定、石蜡包埋的FFPE组织。这个快速的流程可在3小时内完成,且手工操作时间极少。试剂盒中采用高保真性的PCR酶,以减少GC偏向。

    当然,对于外显子组测序、ChIP-Seq等实验而言,还需要一些特定的富集或扩增步骤,但大致流程是相似的,目标也一致,就是让测序文库尽可能的复杂。那么,我们就要尽量避免扩增反应(如PCR)所引入的偏向。大家都知道,GC含量对PCR扩增效率有很大影响。Steven Head建议大家在扩增时使用Kapa HiFi(Kapa Biosystems)或AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Life Technologies)。他认为,这些酶能大幅减少极端GC含量所导致的扩增偏向。


    单细胞测序


    对于大家感兴趣的单细胞基因组测序,目前的策略是通过多重置换扩增(MDA)来实现全基因组的扩增,例如QIAGEN的新品REPLI-g Single Cell Kit。此试剂盒采用优化配方的高保真Phi 29聚合酶,能确保基因座的均匀扩增。同时,它还使用专门的缓冲液和试剂,并引入UV去污染步骤,能消除任何可检测到的残留DNA污染,确保高质量结果仅仅来自您那个宝贵的细胞。


    此外,Fluidigm公司也在去年底为单细胞DNA测序推出了通用的样品制备方案,它可在C1™单细胞自动制备系统上运行。这一方案包括C1 IFC 芯片,C1试剂盒和验证过的程序,而且借力GE illustra GenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒进行全基因组扩增。利用这一方案,研究人员可从单个细胞分离和制备可直接用于测序的文库,在不到一天的时间内平行处理和分析96个单细胞。


    参考文献
    1. Head SR, Komori HK, Lamere SA, et al. Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges. Biotechniques. 2014 Feb 1;56(2):61-77.