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  • 澳门威尼斯人线上娱乐:NGS样品制备指南之RNA

    2015-11-17 12:38:44      点击:
    在经历了几年的高速发展之后,新一代测序仪终于放慢了脚步。如今,样品制备成为NGS中新的亮点。新试剂、新仪器不断涌现,以缩短时间,提高通量。同时,新方法也在不断被开发,以处理更少的样本,如单细胞。这一次,生物通带您走近NGS的样品制备,看看有哪些新工具能帮助我们应对样品制备的挑战。

    高通量RNA测序(RNA-Seq)正成为最受欢迎的NGS应用之一。根据生物通举办的调查,在目前已开展新一代测序的参与者中,大约58%的人会使用NGS测序仪开展转录组测序。RNA-Seq能够在全基因组范围内以单碱基分辨率检测转录本,具有信噪比高、分辨率高、应用范围广等优势,正成为研究基因表达和转录组的重要工具。

    对于RNA-Seq而言,在决定如何制备文库前,首先要考虑测序实验的主要目的。如果目的是探索整体的转录事件,那么文库应捕获整个转录组,包括编码、非编码、反义及基因间RNA,尽可能完整。不过,许多研究的对象是编码mRNA转录本,那么只需要抽取出带poly(A)尾巴的RNA。当然,也有一些研究是聚焦小分子RNA,主要有miRNA、snoRNA、piRNA、snRNA等。


    miRNA测序


    NGS最早应用在RNA-Seq上的成功案例便是miRNA。miRNA测序文库的制备过程很简单,通常是单管反应。以Illumina的操作为例,首先将3’腺苷酸化的DNA接头添加到总RNA样品中miRNA的3’端。然后,在miRNA的5’端添加RNA接头。之后,连接产物经过RT-PCR扩增,引入多重分析的条形码,并产生测序文库。Ion Torrent的流程也相似,不过是在单个反应中连接两端的接头。


    (图片来自Illumina)

    据美国斯克里普斯研究所的Steven Head介绍,当起始RNA的量较少(总RNA< 200 ng)时,问题就来了。在RT-PCR反应中,短的接头二聚体会与目的产物竞争。当太多的接头二聚体存在时,它们涌入凝胶,污染产物条带。为了避免这一问题,许多miRNA文库制备试剂盒都采取了一些措施。

    Bioo Scientific的NEXTflex™ Small RNA测序试剂盒采用AIR™连接酶,这是一种截短的T4 RNA连接酶,能提高小RNA添加接头的效率,带来更高的测序深度。而创新的NEXTflex接头连接技术能减少接头二聚体的污染,产生更多、更高质量的序列read。利用一种专门的RT引物和缓冲液,3’和5’接头二聚体将不再占用宝贵的测序资源。

    mRNA测序


    对于mRNA测序文库的制备,大致过程如下:首先,用Poly(T)寡核苷酸从总RNA中抽取全部带Poly(A)尾的RNA。将所得RNA随机打断成片段,再用随机引物和逆转录酶从RNA片段合成cDNA片段. 然后,对cDNA片段进行末端修复并连接测序接头,得到将用于测序的cDNA。一般还需要用电泳切胶法获取长度范围在200 bp(±25 bp)的cDNA片段,再通过RCR扩增,得到最终的cDNA文库。


    Illumina的TruSeq RNA Sample Preparation Kit如今已升级到第2版。它为RNA文库的生成提供了一个简单而高效的方案。预混液试剂避免了大部分移液步骤,并减少了纯化的量,与过去的方法相比,最大限度地缩短了手工操作时间。


    链特异的RNA-Seq

    样品制备最终得到的是双链DNA文库。在测序过程中,每个read随机地来自双链cDNA中的某一条链,在后续的read定位时需要两个方向都考虑。对于某些研究而言,如长链非编码RNA(lncRNA)分析,转录本的方向对重要,需要在文库制备和测序中保留RNA的方向信息。

    于是,目前也有一些保留方向信息的RNA-Seq样品制备方法被开发出。它们采取的策略是在第二链cDNA合成反应中掺入dUTP,从而选择性去除两条链中的一条。随后这条包含尿嘧啶的链被通过酶学方法去除(NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina),或利用不能识别模板链中尿嘧啶的PCR聚合酶,防止进一步扩增(Illumina TruSeq Stranded Total RNA kit)。此外,放线菌素D也常被添加到第一链cDNA合成反应中,以减少假的反义链合成。

    单细胞RNA-Seq


    RNA-Seq已广泛用于各种组织的基因表达分析,但是对于稀少或珍贵的样品,如干细胞、循环肿瘤细胞或活检组织,因样本量少,这还是个难题。为此,Illumina和Clontech合作开发出SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing。

    这个试剂盒仅需要100 pg总RNA。大致过程如下:一个锚定的oligo-dT引物启动cDNA合成,并添加一个通用的引物序列。接着,SMARTScribe逆转录酶开始逆转录,并在cDNA的3’端添加一些额外的核苷酸。而精心设计的SMARTer Oligonucleotide与这些3’端核苷酸杂交,启动模板切换,让SMARTScribe逆转录酶继续复制。这样,产生的全长单链cDNA就包含完整的mRNA 5’端以及与SMARTer Oligonucleotide互补的序列,可通过PCR扩增。合成后的cDNA可直接用于Illumina测序文库的制备。


    (图片来自Clontech)
    就单个细胞而言,大约只含有10 pg总RNA,而poly(A) RNA更是低至0.1 pg。因此,从一个细胞中获得RNA数据?目前还有难度。现有的方法都需要某种形式的全转录本扩增,才能产生足够的材料,去制备测序文库。当然,这会产生明显的技术噪音,而这一问题至今尚无法解决。不过随着技术的进步,相信研究人员很快会找到破解之道。